【はじめに】
ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)は、ヒトにガス壊疽と食中毒を起こす偏性嫌気性有芽胞細菌である。自己溶解酵素（オートリシン）は、細菌のペプチドグリカンを分解する酵素であるとともに細胞分裂に関与することが知られている。ウェルシュ菌の主たるオートリシンであるAcp (CPE1231)は、分子量120 kDaの酵素でシグナルペプチド、10個のタンデムに並んだSH3bドメインからなる細胞壁結合ドメイン(cell wall-binding domain [CWBD])、N-アセチルグルコサミダーゼ活性ドメイン(AcpCD)で構成される。我々は、Acpが3番目と4番目のSH3bドメイン間で切断され、95 kDa Acpとなること、隔壁および極に局在すること、CWBD がないAcpCDのみを持つ菌では細胞分裂に異常をきたして菌体が長くなることを示してきた。 SH3bドメインの立体構造はすでに明らかになっており、SH3b4からSH3b9までの構造がよく保存されていることが報告されている(Shan, Y. et al. 2021.)。本研究では、Acpが正常に働くためにCWBD内のSH3bドメインがいくつ必要なのか調べた。
【方法】
Acp欠損株（HN13 Δacp）はin-frame deletion法で作製した。1〜10個のSH3bドメイン持つCWBDとAcpCDをコードするacp遺伝子をプラスミドpXC1のキシロース誘導型プロモーター下流に挿入し、Acp欠損株に形質転換した。対数増殖期に0.05%キシロースを培地に添加し、プラスミド上のacp遺伝子に誘導をかけ、菌体の長さに変化が生じるか調べた。その際のグラム染色には、フェイバー法を用いた。Acpの発現はウサギ抗AcpCD抗体を用いたWestern blot法で確認した。Acpの隔壁または極への局在は、培養したウェルシュ菌を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、ウサギ抗AcpCD抗体、Alexa Fluor®594標識抗ウサギIgG抗体を室温で反応させ、共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。さらに、異なった数のSH3bドメインを有するCWBDのC末端にGFPを付加した組換えタンパク質を作製し、ウェルシュ菌菌体と混合した。これらの組換えタンパク質が隔壁に付着するかどうか、再び共焦点レーザー走査型顕微鏡で調べた。
【結果】
Western blot法で調べると1〜10個のSH3bドメインを持つAcpは、ウェルシュ菌Acp欠損株内で発現していた。これらのウェルシュ菌菌体の長さと未分裂細胞数を測定したところ、2つのSH3bドメインしか持たないAcp (9-10CWB+CD)では菌体の長さ、未分裂細胞数が共に有意に増加することが示された。共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察したところ、3つのSH3bドメインを持つAcp (8-10CWB+CD)は、隔壁にシグナルが認められたが、2つのSH3bドメインを持つAcp (9-10CWB+CD)ではシグナルが認められなかった。同様の結果が、異なった数のSH3bドメインを持つCWBD組換えタンパク質をウェルシュ菌に付着させた実験でも得ることができた。
【考察】
以上のことから、ウェルシュ菌のオートリシン(Acp)が隔壁に結合し、細胞分裂を正常に進めるためには、CWBDに少なくとも3つ以上のSH3bドメインが必要であることが明らかになった。
